Linea celular inmortalizada derivada de tejidos de piel humana normal

La presente invención se refiere a una línea celular de queratinocitos humanos inmortalizada por medio de al menos un gen tumorigénico funcional de origen viral, caracterizado porque es (1) no-tumorigénico, (2) conserva la capacidad de diferenciación y de expresar proteínas y enzimas que son expresadas por queratinocitos diferenciados normales aún después de una alta proporción de pasajes en cultivo de tejidos; y (3) forma un epitelio estratificado y polarizado que comprende un stratum corneum orto-queratinocito, si es cultivado en cultivo organotípico en un medio sin suero y sin capa de células alimentadoras. Un método mejorado para inmortalizar células de piel humana para obtener queratinocitos inmortalizados está caracterizado porque comprende las siguientes etapas: (1) obtener una muestra de piel humana; (ii) preparar la muestra de piel para cultivo in vitro; (iii) obtener queratinocitos a partir de esta muestra preparada de tejido de piel y sembrar un medio de crecimiento sin suero con los queratinocitos, sobre placas de cultivo provistas con un revestimiento que comprende fibronectina, BSA y colágeno de tipo I, que facilita la fijación y el crecimiento de las células; (iv) reemplaza el medio de una manera suficiente para obtener un crecimiento confluente optimo de las células en cultivo; manteniendo continuamente el revestimiento de la placa; (v) transferir queratinocitos a un medio de selección sin suero sobre placas de cultivo revestidas previamente de una manera similar; (vi) infectar los queratinocitos con genes tumorigénicos funcionales de al menos dos virus diferentes; (vii) transferir los queratinocitos inmortalizados resultantes a un medio de proliferación sin suero adecuado para la proliferación de queratinocitos inmortalizados sobre placas de cultivo revestidas de antemano de una manera similar; (viii) transferir los queratinocitos que proliferaron resultantes a un medio de diferenciación sin suero, que tiene un alto contenido de calcio, sobre cajas de cultivo revestidas previamente de una manera similar. El uso de queratinocitos para análisis inmunológicos, farmacológicos, foto- y químico-toxicológicos de reacción de la piel y para la expresión de genes heterólogos, y para la construcción de piel artificial.